免疫測定法 基礎から先端まで

生物化学的測定研究会・編 【編集委員】小林典裕/上田宏/三宅司郎/荒川秀俊

免疫測定法 基礎から先端まで

発行
2014/12/20
サイズ
B5判
ページ数
335
ISBN
978-4-06-154385-0
本体
7,800円(税別)
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内容紹介

理論と技術を身につけ、役立つプロトコールとハイテク測定法でスキルアップ。自作抗体でオリジナル研究のエキスパートを目指す!

  免疫測定法の歴史は1959 年に幕を開けた*1.バーソン(Solomon Aaron Berson,1918─1972)とヤロー(Rosalyn Sussman Yalow,1921─2011)が,放射性ヨウ素で標識した抗原(インスリン)と抗体(抗インスリン抗体)との抗原抗体反応を利用したインスリンの超微量定量法,ラジオイムノアッセイ(radioimmunoassay:RIA)を発表したのである.ペプチドホルモンのように,体液中濃度が極めて低いうえ水溶性が大きく,単離精製と濃縮が困難で,化学的・物理的な分析法では太刀打ちできない物質の測定を可能とする革命的な分析法であった.本法は直ちに医学の進歩に大きく貢献した.特に内分泌学の急速な発展は,本法の出現を抜きに語ることはできない.この業績「ラジオイムノアッセイ法の開発」によりヤローは,1977 年,ノーベル生理学・医学賞受賞の栄に輝いた.
 その後,RIA の原理を基盤としつつ,一層の高感度化,あるいは簡便性と汎用性の向上を指向した様々な変法・改良法が,1970~1980 年代にかけて次々と開発された.標識抗体を用いるサンドイッチ型の免疫測定法,酵素免疫測定法(enzyme immunoassay:EIA)に代表される非放射性の測定法,B/F 分離操作が不要なホモジニアス(均一系)アッセイ,そして,現在,「免疫測定法の代名詞」と言えるほどに普及しているELISA(enzyme-linked immunosorbent assay:固定化抗原や固定化抗体を利用したEIA)などである.
  本法における「分析試薬」である抗体の品質についても,抜本的な改革がなされた.1975 年に報告されたハイブリドーマ由来の単一クローン性抗体(1984 年,ノーベル生理学・医学賞)は,測定値の再現性の確保を可能とした.「生きた試薬」に依存するゆえに内在する免疫測定法の泣き所が克服されたのである.応用範囲もおのずと拡大され,臨床検査にとどまらず,生化学や分子生物学の日常実験法としても定着した.現代の生物系や医科学系の研究者・技術者で免疫測定法の恩恵に預からぬ者はほとんどいない.さらに,1980 年代に入ると,食品衛生や環境化学の分野でも本法の有用性が認識され,汚染物質・有害物質の検査を目的とした免疫測定法が次々と開発された.筆者が所属する「生物化学的測定研究会」(旧免疫化学測定法研究会)は,食の安全と環境保全を指向する免疫測定法の発展を支援・推進することを主たる目的として設立されたものである(「付録」参照).
  免疫測定法の本領は,超高感度で特異性が高く,しかも簡便,迅速,同時検体処理能力に優れることである.このため,複雑なマトリックス(媒質)中に混在する極微量生理活性物質のスクリーニングにとりわけ威力を発揮する.そして測定対象となる物質は低分子から高分子まで幅広い.その需要が絶えることはありえない,不滅の分析法である.本法の開発と運用に関する知識・技術の体系は,連綿と,そして的確に継承されていくべきである.しかしながら,残念なことに,現在,指針となる書籍に乏しい.本法の黎明期から1990 年代前半までは,国内外で優れた成書が多数刊行されたが*,その一部は絶版となり入手も容易でない.
  その一方で,免疫測定法は今なお進化を続け,変貌を遂げている.RIA も今だ現役ではあるが,日常検査ではEIA や蛍光免疫測定法を基盤とする非放射性の方法が主体となっている.臨床検査室では全自動測定装置がフル稼動し,多数の検体が新しいホモジニアスアッセイにより効率よく測定されている.他方,ベッドサイドや在宅ではイムノクロマトグラフィーのようなPOCT(point of care testing)に最適な新形態の測定デバイスも活躍している.ハイブリドーマ抗体はとうに常識で,遺伝子操作により作製された人工の(非天然型の)単一クローン性抗体フラグメントも活用されつつある.マイクロチップのような極微細流路内での反応など,ナノバイオ工学や材料工学との接点が発展しつつある.
  しかし,これらの話題の多くは上記の成書に記載がない.1980 年代末のある成書のまえがきに見られる一節,「EIA 法はRIA 法に比べると少し取りつきにくい...」は,今やセピア色の昔話である.インターネット経由であらゆる情報が瞬時に引きだせる時代,とは言え,現代の免疫測定法に関する知識を要領よく体系的に網羅した書籍が存在すべきであり,また重宝するに違いない.
こうした状況を鑑み,「生物化学的測定研究会」内で,毎年2 回の定例学会での講演や討論の成果も還元しつつ,新しい専門書,すなわち本書を編纂せんとする企画が立ち上がった(「あとがき」参照).目指す(願う)ところは以下のようである.
■ 第一線で活躍中の免疫測定法研究者・技術者から初学者まで,広く役立つ新しい知識・情報のセットを提供する.
■ 現代の免疫測定法を俯瞰し,21 世紀初頭の集大成として後世に残す.
■ 免疫測定法に関連する知識・技術を活かして様々な研究領域で活躍せんとする研究者・技術者にも有用な情報源となる.
  その実現のために,今日の多岐にわたる関連項目から話題を厳選した.研究開発の現場でも役立つ書であるために,汎用実験のプロトコルなど具体的な情報をできるだけ盛り込み,単なる総説集にとどまらぬように努めた.第I 編「免疫測定法の基礎」は,これまで繰り返し解説されているものの基盤として欠かせない項目について,最新の展開を織り込みながら,現代の目線で論説した.
専門性が高く取りつきにくい抗体の調製や抗原・抗体の標識については,特に詳しい記述を心がけた.第II 編「新時代の免疫測定法」では,抗体工学(抗体の遺伝子工学),イムノクロマトグラフィー,マイクロチップなど,まさに新時代の話題を取りあげ,そののちに臨床検査,食の安全,環境保全,薬物乱用防止における応用の現況について各論を展開した.
  免疫測定法とその関連技術について,我が国の研究と普及の水準は欧米に決して引けを取らない,と考える.この現状を衰退させず確実に発展させていくうえで本書が一助となるならば,望外の喜びである.

*1 Yalow R. S., Berson S. A., J. Clin. Invest., 39, 1157─1175(1960)を初のRIA の報告とみなし,1960 年に開発された,とする考え方もあるが,多くの場合,Berson S. A., Yalow R. S., J. Clin. Invest., 38, 1996─2016(1959)(RIA の原理が確立され理論的な解析もなされている)とYalow R. S., Berson S. A., Nature, 184, 1648─1649(1959)(RIA をヒト血漿中インスリンの測定に応用している)により,1959 年と解釈されている.
*2 和書の代表例として次の書籍が挙げられる.入江實編,ラジオイムノアッセイ,講談社(1974),入江實編,ラジオイムノアッセイ続,講談社(1979),石川榮治ら編,酵素免疫測定法(第2 版),医学書院(1982),石川榮治ら編,酵素免疫測定法(第3 版),医学書院(1987),北川常廣ら編,蛋白質核酸酵素別冊No. 31,酵素免疫測定法,共立出版(1987),石川榮治,超高感度酵素免疫測定法,学会出版センター(1993).

(まえがき 免疫測定法ミニレビューより)

【執筆者一覧】芦原義弘/新井秀和/荒川秀俊/有薗幸司/生田和良/伊藤俊幸/伊藤道雄/伊東祐二/上田宏/榎元友里恵/太田光熙/大野賢一/大山浩之/笠原靖/川村憲一/小林典裕/作道章一/桜井錠治/佐々木正大/佐野佳弘/澤田石一之/高木康/高木陽子/中野秀雄/丹羽俊文/平井到/福田滋弘/藤波綾/細川和生/本庄勉/本間雅史/三宅司郎/宮﨑誠生/森田いずみ

目次

第Ⅰ編 免疫測定法の基礎

1. 測定原理と分類
1.1 はじめに
1.2 測定対象による分類
1.3 反応スケールと場による分類
1.4 測定原理による分類
1.4.1 競合型非均一系標識免疫測定法(グループⅠ)
1.4.2 非競合型非均一系標識免疫測定法(グループⅡ)
1.4.3 競合型均一系標識免疫測定法(グループⅢ─1)
1.4.4 非競合型均一系標識免疫測定法(グループⅢ─2)
1.4.5 非標識均一系免疫測定法(グループⅣ─1,2)

2. 免疫測定法の化学
2.1 抗体の構造と機能
2.1.1 はじめに
2.1.2 抗体(免疫グロブリン)の種類
2.1.3 抗体の構造と機能
2.1.4 抗体フラグメント
2.1.5 抗原抗体反応の化学
2.2 抗原抗体反応の物理化学
2.2.1 はじめに
2.2.2 抗原抗体反応の化学平衡
2.2.3 結合定数の算出
2.2.4 抗原抗体反応の速度論
2.2.5 抗原抗体反応の熱力学
2.3 その他のアフィニティー結合
2.3.1 はじめに
2.3.2 抗体結合タンパク質
2.3.3 抗体結合タンパク質に基づく検出試薬
2.3.4 ビオチンと(ストレプト)アビジンの構造と反応
2.3.5 ビオチン化と(ストレプト)アビジン試薬

3. 「試薬」の調製
3.1 抗体調製総論
3.1.1 はじめに
3.1.2 抗体産生の機構
3.1.3 抗体(invivo抗体)調製の実際
3.1.4 遺伝子操作によるinvitro抗体の作製
3.1.5 抗体のキャラクタリゼーション
3.2 高分子抗原に対する抗体の調製
3.2.1 はじめに
3.2.2 免疫原の調製
3.2.3 免疫原の精製
3.2.4 精製抗原の純度検定
3.2.5 免疫動物とその特徴
3.2.6 免疫原の投与方法と投与経路
3.2.7 抗体の精製
3.3 低分子抗原に対する抗体の調製
3.3.1 はじめに
3.3.2 ハプテン─キャリヤー結合体の調製
3.3.3 免疫と力価の検定
3.3.4 抗ハプテン抗体の調製に際しての留意点
3.4 抗原・抗体の標識
3.4.1 はじめに
3.4.2 標識に使用される代表的な酵素
3.4.3 ハプテン(低分子抗原)の酵素標識
3.4.4 高分子抗原の酵素標識
3.4.5 抗体(IgG)の酵素標識

4. 免疫測定法の検出系
4.1 免疫測定法における比色検出と蛍光検出
4.1.1 はじめに
4.1.2 検出法の変遷と標識酵素
4.1.3 酵素活性の測定法
4.1.4 おわりに
4.2 免疫測定法における発光検出
4.2.1 はじめに
4.2.2 化学発光および生物発光イムノアッセイ
4.2.3 化学発光イムノアッセイの検出法
4.2.4 化学発光酵素イムノアッセイの検出法
4.2.5 生物発光酵素イムノアッセイの検出法
4.2.6 生物発光イムノアッセイの検出法
4.2.7 電気化学発光イムノアッセイ
4.3 蛍光・発光標識とその検出
4.3.1 はじめに
4.3.2 免疫測定に用いられる蛍光色素
4.3.3 抗体の蛍光標識
4.3.4 蛍光修飾抗体を用いた免疫測定の例
4.3.5 発光標識を利用した方法
4.4 金コロイド標識とその検出
4.4.1 はじめに
4.4.2 粒子径
4.4.3 吸収曲線
4.4.4 タンパク質との結合
4.4.5 金コロイド標識の検出方法
4.4.6 装置を使用した検出
4.5 DNA標識とその検出
4.5.1 はじめに
4.5.2 PCRとは
4.5.3 immuno─PCRについて
4.5.4 DNAの標識法
4.5.5 immuno─PCRの今後

5. 免疫測定法の分析能評価
5.1 はじめに
5.2 分析法バリデーション指針と分析能パラメーター
5.3 免疫測定法の開発手順と評価の実際
5.4 分析能パラメーターの評価方法
5.4.1 検出限界と定量限界
5.4.2 範囲
5.4.3 特異性と真度
5.4.4 精度
5.4.5 頑健性

第Ⅱ編 新時代の免疫測定法

6. 抗体工学とその応用
6.1 ファージディスプレイ法
6.1.1 はじめに
6.1.2 抗体ライブラリーの構築
6.1.3 ヒト抗体ファージライブラリーからの特異抗体の選別
6.1.4 アルパカVHH抗体ファージライブラリー
6.2 無細胞系を用いた抗体合成と抗体選択
6.2.1 はじめに
6.2.2 無細胞タンパク質合成系による抗体合成
6.2.3 無細胞タンパク質合成系による抗体スクリーニングシステム
6.2.4 おわりに
6.3 抗体の試験管内親和性成熟
6.3.1 はじめに
6.3.2 抗体の親和力とアッセイ感度
6.3.3 試験管内親和性成熟の原理
6.3.4 試験管内親和性成熟の実際
6.3.5 おわりに
6.4 タンパク質工学による抗原・抗体の標識
6.4.1 はじめに
6.4.2 酵素融合タンパク質
6.4.3 蛍光・発光タンパク質との融合
6.4.4 融合タグ配列
6.4.5 遺伝子融合以外の標識法
6.4.6 おわりに
6.5 蛍光標識抗体断片の消光解消法(Q─body)
6.5.1 はじめに
6.5.2 蛍光偏光法などの従来法
6.5.3 試薬いらずのバイオセンサー
6.5.4 蛍光共鳴エネルギー移動とオープンサンドイッチ原理を利用した方法
6.5.5 クエンチ解消原理に基づく蛍光バイオセンサーquenchbody

7. 新しい反応系に基づく免疫測定法
7.1 イムノクロマトグラフィー
7.1.1 はじめに
7.1.2 イムノクロマトグラフィー検査キットの原理
7.1.3 イムノクロマトグラフィー検査キットの使用例
7.1.4 感度,特異度
7.1.5 イムノクロマトグラフィー検査キットの使用上の注意点
7.1.6 イムノクロマトグラフィー検査キットの問題点および課題
7.1.7 イムノクロマトグラフィー検査キットの応用
7.2 フローシステムを用いる免疫センサー
7.2.1 はじめに
7.2.2 測定方法の概略
7.2.3 フロー免疫センサーの実用化
7.2.4 精度管理
7.2.5 おわりに
7.3 マイクロチップを用いる免疫測定法
7.3.1 はじめに
7.3.2 各論
7.3.3 おわりに
7.4 マイクロチップを用いる免疫測定法の臨床応用
7.4.1 はじめに
7.4.2 μTASとPOCT
7.4.3 スポットケムバナリストの特徴
7.4.4 おわりに
7.5 表面プラズモンセンサー(SPR)を活用した免疫測定法
7.5.1 はじめに
7.5.2 表面プラズモン共鳴とは
7.5.3 SPRによる結合定数の測定
7.5.4 その他のラベルフリー測定法

8. 臨床検査における免疫測定法
8.1 各種測定項目
8.1.1 はじめに
8.1.2 低分子生理活性物質(ホルモン)
8.1.3 ペプチドホルモン
8.1.4 腫瘍マーカー
8.1.5 ウイルス感染症
8.1.6 細菌
8.1.7 自己抗体検査法
8.1.8 血液凝固線溶系
8.2 自動化
8.2.1 ラテックス凝集法
8.2.2 化学発光法
8.2.3 LOCI法
8.3 精度管理
8.3.1 はじめに
8.3.2 臨床検査手順と精度管理
8.3.3 精度管理
8.3.4 内部精度管理
8.3.5 外部精度管理
8.3.6 イムノアッセイの精度管理
8.3.7 おわりに
8.4 臨床検査における非特異反応
8.4.1 はじめに
8.4.2 検体マトリックス中の共存成分に起因するもの
8.4.3 検体前処理の不備によるもの
8.4.4 測定キット中の試薬・器材に起因するもの
8.4.5 服用薬剤による影響
8.4.6 非特異反応の発見と対応

9. 食の安全に貢献する免疫測定法
9.1 腸管出血性大腸菌
9.1.1 はじめに
9.1.2 O抗原(菌体抗原)
9.1.3 志賀毒素
9.1.4 検査方法
9.1.5 O157抗原に対する抗体作製
9.1.6 志賀毒素に対する抗体作製
9.1.7 市販の腸管出血性大腸菌検査キット
9.1.8 おわりに
9.2 狂牛病(プリオン)
9.2.1 はじめに
9.2.2 正常型プリオンタンパク質と異常型プリオンタンパク質
9.2.3 主要なプリオン免疫測定法
9.2.4 プリオン検出法の改良
9.2.5 プリオン病生前診断法開発
9.2.6 今後の展開
9.3 アレルギー物質
9.3.1 はじめに
9.3.2 特定原材料測定キットの開発
9.3.3 測定キットの改良
9.3.4 グルテンフリー食品の測定
9.3.5 更なるキットの改良と簡易免疫測定法の開発
9.4 農 薬
9.4.1 はじめに
9.4.2 農薬に対する抗体を作製するためのハプテンデザイン
9.4.3 農薬に対する直接競合ELISAとそのキット
9.4.4 農産物中の残留農薬測定
9.4.5 農薬測定のイムノクロマト化
9.4.6 おわりに
9.5 カビ毒
9.5.1 はじめに
9.5.2 アフラトキシン
9.5.3 オクラトキシン
9.5.4 トリコテセン系カビ毒
9.5.5 その他のカビ毒
9.5.6 国内で入手可能なカビ毒用ELISAキットとイムノクロマトキット
9.5.7 おわりに

10. 環境保全に貢献する免疫測定法
10.1 内分泌撹乱物質
10.1.1 はじめに
10.1.2 環境ホルモンの測定におけるELISA
10.1.3 ビスフェノールA ELISAの測定原理と性能
10.2 ダイオキシン類の免疫測定法
10.2.1 はじめに
10.2.2 免疫測定法の必要性
10.2.3 測定対象化合物
10.2.4 抗体開発戦略
10.2.5 ハプテン設計
10.2.6 モノクローナル抗体
10.2.7 試料調製法(前処理法)
10.2.8 機器分析法との比較
10.2.9 公定法として
10.2.10 おわりに
10.3 ポリ塩化ビフェニル(PCB)の免疫測定法
10.3.1 はじめに
10.3.2 免疫測定法の必要性
10.3.3 測定対象化合物
10.3.4 抗体開発戦略
10.3.5 ハプテン設計
10.3.6 モノクローナル抗体
10.3.7 試料調製法(前処理法)
10.3.8 機器分析法との比較
10.3.9 公的な評価
10.3.10 おわりに
10.4 カドミウム
10.4.1 はじめに
10.4.2 免疫測定法の適用
10.4.3 抗体の作製
10.4.4 前処理法
10.4.5 イムノクロマトグラフィー
10.4.6 機器分析法との相関
10.4.7 オンサイト分析への適用
10.4.8 その他の食品への応用
10.4.9 おわりに

11. 乱用薬物の免疫測定法
11.1 はじめに
11.2 乱用薬物イムノアッセイの原理
11.2.1 概要
11.2.2 EMIT法
11.2.3 イムノクロマト法
11.3 乱用薬物イムノアッセイキットの実際
11.3.1 日本で使用されている主なキット
11.3.2 キットの使用方法
11.3.3 キットの特異性と感度
11.4 新たなシステムの紹介
11.5 乱用薬物イムノアッセイへの期待

付録 免疫測定法の標準化